Elintavoiltaan erittäin monimuotoinen ryhmä.

Ravintona toukilla usein lahoava tai mätänevä orgaaninen aines, kuten kasvijäte, lanta tai raadot; joskus sienet ja sienirihmastot, elävät kasvit, levät ja muut veden pieneliöt; toisinaan petoja tai selkärankaisten pesä- tai sisäloisia, joskus hyönteisten parasitoideja. Voivat aiheuttaa kasveihin äkämiä (äkämäsääsket, Cecidomyiidae) tai olla miinaajia kaivaen kiemurtelevia käytäviä kasvien lehtiin. Aikuisilla ravintolähde on nestemäinen: mesi, siitepöly, toiset hyönteiset ja niiden kudosneste, selkärankaisten veri ja ihon eritteet.

Kaksisiipiset ovat usein erittäin taitavia ja nopeita lentäjiä: jotkin voivat lentää pysyen paikallaan (esim. kukkakärpäset, Syrphidae). Kävellessään jotkin pystyvät astelemaan pystysuoria pintoja tai jopa ylösalaisin jalkojen liuskojen, pulvillien tuottaman adheesion vuoksi.

Jotkin matkivat taitavasti myrkkypistiäisiä (Batesin mimikry): kukkakärpästen (Syrphidae) tai naamiokärpästen (Conopidae) varoitusväritys muistuttaa myrkkypistiäisten väritystä, kun taas kimalaiskärpäsillä (Bombyliidae) niiden muoto ja karvaisuus viittaavat myrkyllisiin kimalaisiin (Bombus).

Aikuiset kaksisiipiset voivat harjoittaa reviirikäyttäytymistä ajaen pois oman ja vieraiden lajien edustajia reviiriltään.

True flies – Diptera